"Laureaci tegorocznej nagrody Nobla w dziedzinie chemii opracowali metody, które dają nam możliwości tworzenia tak zwanych przeciwciał monoklonalnych, bardzo obiecujących w terapii wielu chorób, nie tylko nowotworowych, ale i np. zapalnych" – mówi RMF FM prof. Joanna Bereta. Szefowa Zakładu Biologii Komórki Uniwersytetu Jagiellońskiego tłumaczy, jak takie przeciwciała praktycznie w laboratorium powstają. Nagroda przypadła w tym roku Amerykance Frances H. Arnhold, jej rodakowi George’owi P. Smithowi i Brytyjczykowi Gregory’emu P. Winterowi. Opracowane przez nich metody ukierunkowanej ewolucji enzymów znalazły wiele zastosowań także w przemyśle, do produkcji biopaliw czy detergentów.

Posłuchaj całej rozmowy z szefową Zakładu Biologii Komórki UJ

Grzegorz Jasiński: Królewska Szwedzka Akademia Nauk ogłosiła, że przyznała tegoroczną nagrodę Nobla w dziedzinie chemii badaczom, którzy dokonali rewolucji, wykorzystując do tego taką, sterowaną ewolucję. Na czym ten pomysł sterowania ewolucją polegał?

Prof. Joanna Bereta: Zacznijmy od przypomnienia, czym jest ewolucja. W największym skrócie ewolucja zaczyna się od mutacji genu. Wiadomo, że geny kodują białka, a białka wykonują wszelkie prace w naszym organizmie. Jeżeli taka mutacja powoduje, że białko będzie troszkę zmienione i ta zmiana będzie korzystna, to ta zmiana będzie utrwalana z pokolenia na pokolenie, to białko nabierze trochę innych, korzystnych dla nas, nowych cech. Jeżeli taka zmiana będzie niekorzystna, białko będzie miało strukturę gorszą, zmienioną dla nas w sposób niekorzystny, taki organizm będzie miał mniejsze szanse na przetrwanie i z czasem tej ewolucji on zniknie z powierzchni Ziemi. Ponieważ wiemy, że w toku ewolucji te białka się zmieniały, możemy sobie wyobrazić, że jeżeli będziemy w stanie sami sterować taką ewolucją, czyli powodować mutacje, a następnie selekcjonować białka o cechach o jakie nam chodzi, korzystnych dla nas z różnego punktu widzenia, przemysłowego albo terapeutycznego, to jesteśmy wygrani. Na tym właśnie polegała wieloletnia praca trojga tegorocznych laureatów nagrody Nobla z chemii. Ta praca wykorzystała do selekcji zmodyfikowanych białek właśnie te mechanizmy ewolucji.

Oni posłużyli się różnymi metodami Frances Arnold miała swój sposób na tę sterowaną ewolucję białek, George Smith i Gregory Winter posługiwali się bakteriofagami. Zacznijmy od tej pierwszej metody...

Ta pierwsza metoda też wykorzystywała bakteriofagi. Tak naprawdę prekursorem prac, które pozwoliły na osiągniecie tego celu był profesor Smith, który wprowadził metodę po angielsku zwaną "phage display", czyli ekspresji fagowej. W tej metodzie zaprzęgamy do pracy bakteriofagi, bo zależy nam na tym, by w jakiejś jednostce mieć zarówno gen, jaki i białko, które ten gen koduje. Czymś takim jest bakteriofag, malutki, z małym genomem. Można do niego wprowadzić dowolny gen, który koduje interesujące nas białko...

A ponieważ to wirus, który atakuje bakterie, wnika w nie, może wykorzystywać całą ich aparaturę...

Tak jest. I wtedy ta bakteria będzie produkować białka, których kodujące geny ma właśnie ten bakteriofag. Tak naprawdę to białko będzie wbudowywane w bakteriofaga, on będzie prezentował to białko na swojej powierzchni. Całe piękno polega na tym, że my mamy całą bibliotekę, zbiór bakteriofagów, które noszą w sobie inne geny albo geny kodujące to samo białko, ale lekko zmodyfikowane. Frances Arnold miała bakteriofagi zawierające gen kodujący jakiś enzym, mutowała ten gen i każdy bakteriofag prezentował nieco zmodyfikowany enzym. Natomiast profesor Winter wykorzystał ekspresję fagową do produkcji przeciwciał. W naszym organizmie mamy miliony różnych przeciwciał. Jeśli jesteśmy w stanie gen kodujący przeciwciała wstawić do genomu bakteriofaga i mutować, otrzymujemy bibliotekę bakteriofagów, produkujących inne przeciwciała. Możemy wyselekcjonować bakteriofagi, które produkują przeciwciała, które mają specyficzność do konkretnego antygenu, na przykład antygenu na powierzchni komórki nowotworowej albo do białka, które powoduje jakieś choroby.

Dzięki pracy tegorocznych laureatów mamy możliwość skojarzenia pewnych modyfikacji genów z pewnymi modyfikacjami białek, które mogą być dla nas korzystne...

Tak. Ja wrócę jeszcze do tej ewolucji, bo my tu wprowadzamy jakąś zmianę, a potem selekcjonujemy z pomocą tych bakteriofagów. Możemy z miliardów bakteriofagów wyselekcjonować te, które są dla nas korzystne. Skupiamy się na konkretnej cesze, która dla nas jest ważna. Na przykład pani Arnold chciała mieć enzym, który będzie wytrzymywał wysoka temperaturę. W związku z tym przeprowadziła selekcję tak, by wybrać bakteriofagi, które kodują tak zmieniony enzym, że jest wytrzymały. Profesor Winter chciał wyselekcjonować, znaleźć takie bakteriofagi, które kodują przeciwciało rozpoznające jakiś czynnik. pierwszym, bardzo powszechnie stosowanym przeciwciałem jest Humira, rozpoznająca czynnik martwicy nowotworu, cytokinę, która produkowana w nadmiarze jest bardzo uciążliwa i szkodliwa. To cytokina, która potęguje na przykład reumatoidalne zapalenie stawów. Dla osób cierpiących na te chorobę to bardzo skuteczny lek. Trudno oczywiście powiedzieć, że on leczy chorobę, to jest lek który...

Blokuje działanie czynnika, który ją rozpędza?

Tak, można tak powiedzieć. Reumatoidalne zapalenie stawów jest chorobą postępującą, która rozwija się z wiekiem. Można powiedzieć, że to przeciwciało nie leczy, ale hamuje rozwój choroby, sprawia, że życie pacjenta jest lepsze, jest sprawniejszy, choroba nie jest taka dokuczliwa, objawy są złagodzone.

Mówiliśmy o takim teoretycznym obrazie sytuacji, ale tutaj w laboratorium państwo tego typu badania prowadzicie, tego typu eksperymenty wykonujecie, jak to więc praktycznie się odbywa? Bierze się szkiełko i tam się te bakterie z tymi bakteriofagami łączy pod mikroskopem?

Nie ma mikroskopu. To jest połączenie metod inżynierii genetycznej, metod mikrobiologii, metod biologii komórki i biochemii. Jak to się robi? Trzeba mieć biblioteki bakteriofagów. My korzystamy z takiej, która zawiera fragmenty przeciwciał, ludzkie geny kodujące przeciwciała. Jeśli chcemy, by potem takie przeciwciało było stosowane w terapii, mamy od razu ludzkie przeciwciało. Nie ma problemu, że mielibyśmy podawać człowiekowi obce gatunkowo białko i obawiać się reakcji układu odpornościowego. Przy pierwszych przeciwciałach monoklonalnych to był problem.

Jak ta biblioteka wygląda? To są fiolki, probówki, słoiczki?

To probówka zawierająca taki, nieco mętny płyn, zawiesinę fagów. To są tak maleńkie stworki, że my ich nawet pod mikroskopem nie widzimy. I potem konkretny szczep bakterii zakażamy konkretnymi bakteriofagami, namnażamy te bakterie i im więcej mamy tych bakterii, tym więcej mamy również tych fagów. Fagi wydostają się z bakterii i możemy przeprowadzać selekcję. Jeśli chcemy uzyskać przeciwciała rozpoznające jakiś antygen nowotworowy, musimy mieć ten antygen, musimy nim pokryć powierzchnię probówki. To się dzieje samo, białko pokrywają specjalnie spreparowany plastik, nie ma problemu. Do takiej probówki, która jest pokryta antygenem, białkiem przeciw któremu chcemy uzyskać przeciwciała, dodajemy mieszaninę fagów. One mają geny kodujące dane białka, a na powierzchni same te białka. Białka, które rozpoznają antygen, wiążą się z nim. Powiedzmy, że zwiąże się sto różnych fagów. Całą resztę wypłukujemy, wylewamy do zlewu. Te, które się związały musimy z kolei namnożyć. Zakażamy tymi fagami następną porcję bakterii, pojawia się jeszcze więcej fagów, przy czym myśmy już sprawili, że ta nasza biblioteka fagów będzie bardziej specyficzna. Mamy więcej fagów, które pozwalają na produkcję przeciwciał, skierowanych przeciw konkretnym antygenom. Te, które się nie wiążą, wylaliśmy. Znów namnażamy, powtarzamy tę selekcję jeszcze raz i kolejny, wzbogacamy bibliotekę o te fagi, o które nam chodzi, które mają gen kodujący nasze przeciwciało. Potem jest dalsza praca, polegająca na tym, że w momencie kiedy mamy mocno wzbogaconą bibliotekę, musimy uzyskać fagi monoklonalne. W ten sposób uzyskujemy 100 albo 500 osobnych hodowli przeciwciał, z których wybieramy jedno, dwa, trzy najlepsze.

I to są te przeciwciała tak zwane monoklonalne, które między innymi są wielką nadzieją onkologii...

Tak jest. Nie tylko onkologii, bo one w tej chwili mają coraz szersze zastosowania. Co roku jest kilka nowych przeciwciał, zatwierdzanych przez FDA, amerykańską Agencję do spraw Żywności i Leków albo w Europie przez Europejską Agencję Leków. I rzeczywiście większość to leki, które można stosować w onkologii, w terapii przeciwnowotworowej, ale mamy też takie, które stosuje się w chorobach o podłożu chronicznego stanu zapalnego, jak reumatoidalne zapalenie stawów, czy choroba Crohna lub łuszczyca. Mamy też przeciwciała stosowane w transplantologii, które mają zapobiegać odrzuceniu przeszczepionych narządów. Coraz więcej też jest nowych przeciwciał monoklonalnych, przeciwwirusowych albo przeciwbakteryjnych. Pojawiły się na przykład przeciwciała przeciw wąglikowi. Strach przed użyciem wąglika jako broni biologicznej masowego rażenia może być nieco mniejszy, bo mamy przeciwciała, które mogą nas skutecznie przed tym bronić.

To wciąż są bardzo drogie procedury...

Terapie są bardzo drogie. Nie chcę skłamać, ale przy chronicznych chorobach to jest kilkadziesiąt tysięcy złotych miesięcznie, zwykle to są dwa podania w miesiącu. Nie potrafię powiedzieć, ile takich leków jest w tej chwili dostępnych, zatwierdzonych przez NFZ do refundacji. Polscy lekarze robią tu wiele dobrego, starają się, by te nowe leki wchodziły jako terapie eksperymentalne, na tym etapie, kiedy jeszcze są terapiami eksperymentalnymi, by pacjenci mogli z nich korzystać.

Te przeciwciała muszą być dopasowane do organizmu konkretnego pacjenta, czy raczej są to terapie nakierowane na nowotwory pewnego typu, kodowane jakąś konkretną mutacją, choćby w przypadku nowotworów piersi?

W tej chwili jest taki bardzo modny kierunek personalizacji medycyny. Ale tak naprawdę to początkiem tworzenia przeciwciał monoklonalnych była idea, by lek służył jak największej grupie pacjentów. Firmom farmaceutycznym nie opłaca się produkować leku dla garstki. To by było zbyt drogie. Kiedy lek jest już na rynku, stosujemy go u pacjentów, cały czas trwają dalsze badania naukowe, jak taki lek u różnych pacjentów się sprawdza. W przypadku raka piersi jest taki antygen, który nazywa się HER2. Jest też powszechnie stosowane przeciwciało anty-HER2, które z niewiadomych przyczyn u jednych pacjentek działa lepiej, u innych gorzej. I jest tak nawet wtedy, gdy pacjentki mają dokładnie taki sam poziom antygenu na powierzchni komórek nowotworowych. To było dziwne, ale potem okazało się, że przeciwciała monoklonalne działają na dwa sposoby. HER2 jest receptorem czynnika wzrostowego i jeśli przeciwciało się z nim zwiąże, zablokuje działanie tego receptora i spowalnia namnażanie się tych komórek. Z drugiej strony przeciwciało jest sygnałem dla całego układu odpornościowego organizmu i do zabijania komórek nowotworowych angażuje też inne komórki. Okazało się, że można przygotować jakby dwa formaty przeciwciał, które będą rozpoznawać dokładnie ten sam receptor, ale będą nieco odmiennie oddziaływać z naszym układem odpornościowym. U jednych pacjentek skuteczniejszy będzie jeden format, u innych drugi. To jest do przyjęcia dla firm farmaceutycznych, nie muszą przygotowywać stu przeciwciał, wystarczą dwa formaty, dla jednej grupy pacjentek taki, dla drugiej inny. To taka częściowa personalizacja, ale to może przynieść skutki. 

(m)